豬流行性腹瀉病毒抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

使用說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名：豬流行性腹瀉病毒抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

英文名：Test Kit for Antibodies to Porcine Epidemic Diarrhea Virus (ELISA)

【包裝規(guī)格】 96T×1/盒、96T×2/盒、96T×5/盒

【預(yù)期用途】 豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為基本特征，各種年齡的豬均易感。

本試劑盒用于檢測豬血清、血漿中豬流行性腹瀉病毒抗體，可用于豬流行性腹瀉病毒疫苗免疫效果評價。

【原    理】

    本試劑盒由預(yù)包被豬流行性腹瀉病毒重組N蛋白的酶標板、酶標記物及其他配套試劑組成，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）原理檢測豬血清、血漿樣本中豬流行性腹瀉病毒抗體。實驗時在酶標板中加入對照血清和待檢樣本，經(jīng)溫育后若樣品中含有豬流行性腹瀉病毒抗體，則將與酶標板上抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的其他成分后；再加入酶標記物，與酶標板上抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶標記物，在孔中加TMB底物液，與酶標結(jié)合物反應(yīng)形成藍色產(chǎn)物，顯色深淺與樣品中的特異性抗體含量成正相關(guān)；加入終止液終止反應(yīng)后，產(chǎn)物變?yōu)辄S色；用酶標儀在450nm波長測定各反應(yīng)孔中的吸光值，即可知樣品是否含有豬流行性腹瀉病毒抗體。

【試劑盒組成】

【儲存及有效期】 2～8℃保存，有效期12個月。

包被板開封后請于2～8℃避光保存，避免受潮。使用期限為2個月。

【適用儀器】 含450nm、630nm波長的酶標儀，37℃恒溫設(shè)備，可調(diào)微量移液器。

【樣品準備】

1.取動物全血按常規(guī)方法制備血清，要求血清清亮，無溶血、無污染。樣品1周內(nèi)可于2～8℃保存，長期需置-20℃保存。

2.用樣品稀釋液將待檢血清按40倍稀釋（如5μl血清加入195μl樣品稀釋液中，混勻）。陰、陽性對照不用稀釋。

3.濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫使沉淀溶解，然后用蒸餾水或去離子水作20倍稀釋成工作洗滌液(如19份蒸餾水或去離子水+1份濃縮洗滌液)。

【檢驗方法】

1.使用前將試劑盒置室溫30分鐘，恢復(fù)至室溫。

2.取所需用量酶標板條，設(shè)空白對照1孔、陰性/陽性對照各2孔，未用的板條盡快密封，2～8℃保存。

3.空白對照孔加樣品稀釋液100μl；陰、陽性對照孔分別加入陰、陽性對照100μl；樣品孔每孔加入稀釋后的樣品100μl。

4.混勻，蓋好蓋板膜，置37℃（推薦水浴）避光反應(yīng)30分鐘。

5.甩去孔內(nèi)液體，每孔加350 ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干。

6.每孔加酶標記物100μl（空白孔除外）。蓋好蓋板膜，置37℃避光反應(yīng)30分鐘。

7.洗滌，同步驟5。

8.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl，混勻，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應(yīng)10分鐘。

9.每孔加終止液50μl，混勻，于450nm(可用630nm作參比波長）測定各孔吸光值，無參比波長用空白孔調(diào)零(即所有孔吸光值減去空白孔吸光值)。

【參考值】實驗正常的情況下，陰性對照的平均OD值即ODNC應(yīng)≤0.3，陽性對照的平均OD值即ODPC應(yīng)≥0.6。

【檢驗結(jié)果的解釋】

1.樣品的OD值即ODS；

2.閾值計算：SP值=（ODS-ODNC）/（ODPC-ODNC）；

SP值≥0.2，結(jié)果判定為陽性；SP值＜0.2，結(jié)果判定為陰性。

3.本實驗結(jié)果為陰性時表明豬只抗體水平不足，建議補打相應(yīng)疫苗。

【試驗方法的局限性】

    該試驗僅作為定性檢測豬血清、血漿中豬流行性腹瀉病毒抗體，根據(jù)SP值高低可作抗體水平強、中、弱的粗略評估。

【注意事項】

1.實驗操作時需戴手套、穿工作衣，嚴格健全和執(zhí)行消毒隔離制度，各種實驗廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

2.終止液具有腐蝕性，應(yīng)避免接觸皮膚和衣物，如不慎接觸請立即用大量自來水沖洗。

3.酶標板從冷藏環(huán)境中取出時應(yīng)恢復(fù)至室溫方可開袋，未用完的酶標板需放入有干燥劑的密封袋中保存。

4.濃縮洗滌液在低溫時容易結(jié)晶，使用時需恢復(fù)至室溫以完quan溶解。

5.洗滌時各孔均需加滿液體，防止孔口有游離酶不能洗凈。

6.用于檢測的樣品應(yīng)保持新鮮。

7.試驗結(jié)果的判定必須以酶標儀讀數(shù)為準。

8.不同批號試劑組分不得混用。